(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 20221087593 0.6 (22)申请日 2022.07.22 (71)申请人 广西大学 地址 530004 广西壮 族自治区南宁市西乡 塘大学东路100号广西大学轻工与食 品工程学院 (72)发明人 李全阳　张钦任　周玉盼　 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克 曼氏菌的方法 (57)摘要 嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia   muciniphila， 简称Akk菌)是一类世界公认的潜 在益生菌， 但由于对营养要求非常苛刻， 分离培 养极其困难， 导致对该菌的分离培养、 研究开发 进展缓慢。 本发 明给出一种复合调控剂特异性筛 选Akk菌的方法， 属于微生物技术领域。 所述的复 合调控剂包括调控剂A、 调控剂B、 调控剂C。 采用 的培养基是以脑心浸液肉汤培养基(Brain   Heart Infusion， 简称BHI)为基础进行改良或能 培养Akk菌的合成培养基。 本发明的复合调控剂 培养基能同时抑制粪便样品中的革兰氏阳性菌 和革兰氏阴性菌， 且对Akk菌基本上没有抑制作 用， 还具有一定的促进生长作用， 使得其在平板 表面良好生长， 降低了复杂混合样品中Akk菌的 筛选难度， 对Ak k菌的筛选培养具有重要意 义。 权利要求书1页 说明书7页 附图3页 CN 115141778 A 2022.10.04 CN 115141778 A 1.一种复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法， 其特征在于， 所述的复合 调控剂为调控剂A、 调控剂B、 调控剂C 。 2.如权利要求1所述的复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法， 其特征在 于， 所述的复合调控剂配方为6ug/ml调控剂A、 10ug/ml调控剂B、 12ug/ml调控剂B。 3.如权利要求1的复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法， 其特征在于， 所 述的筛选采用的培 养基为改良BHI培 养基。 4.如权利要求3所述的复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法， 其特征在 于， 所述的改良BHI培养基配方为脑心浸液肉汤38.5g/L、 酵母浸粉5g/L、 黏蛋白2.5g/L、 刃 天青1mg/L、 L ‑半胱氨酸0.5g/L、 碳 酸氢钠0.2 94g/L。 5.如权利要求2和4所述的复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法， 其特征 在于， 所述的复合调控剂改良BHI特异性培 养基的配制方法为： S1： 调控剂溶液的配制： 将调控剂A溶于无菌超纯水， 配制成6ug/mL的母液， 将调控剂B 溶于无菌超纯水， 配制成10ug/mL的母液， 将调控剂C溶解于无菌超纯水， 配制成12u g/mL的 母液， 过滤除菌放置4℃冰箱备用； S2： 黏蛋白溶液的配制及纯化： 将黏蛋白溶于PH＝7.4 的PBS缓冲液， 浓度为1％(W/V)， 室温下， 磁力搅拌2h， 待其充分溶解后再以8000rpm离心15min， 取上清， 也冷至0～2℃， 得到 上清液。 在上清液中加入预冷至4℃的乙醇， 至乙醇终浓度为60％， 轻轻颠倒 混匀， 4℃静置 2h后弃去 上清， 用蒸馏水重新溶解沉淀至其纯化前的体积， 121℃高压蒸汽灭菌20 min， 待其 降温后分装至 50mL无菌离心管中， 放置 ‑20℃冰箱中， 备用； S3： 刃天青的配制： 将刃天青溶解于蒸馏水， 得到0.005％(W/V)(0.05mg/mL)的刃天青 母液， 放置4℃冰箱中， 备用； S4： L‑半胱氨酸的配制： 将L ‑半胱氨酸溶解于蒸馏水， 得到10％(W/V)(0.1g/mL)的L ‑半 胱氨酸溶 液母液， 过 滤除菌备用； S5： 碳酸氢钠溶液的配制： 将NaHCO3溶于蒸馏水， 得到3％(W/V)(0.03g/mL)的NaHCO3母 液， 过滤除菌备用； S6： 取脑心浸液肉汤38.5g， 酵母浸粉5g， 0.005％(W/V)刃天青4mL定容于1L蒸馏水中， 混合均匀后， 121℃高压蒸汽灭菌20min， 然后取150mL灭菌液加入50mL步骤S1的黏蛋白溶 液， 混合均匀后加入1mL步骤S3的L ‑半胱氨酸溶液和200uL步骤S 4的NaHCO3母液， 得改良B HI 培养基(若需 固体培养基， 则在灭菌前 添加1～1.5％琼脂)； S7： 待上述混合好的改良BHI培养基冷却至40～50℃左右， 分别添加调控剂A、 调控剂B、 调控剂C母液200uL到改良BHI培养基中， 摇晃均匀， 在其凝固前倒平板， 得到复合调控剂改 良BHI特异性筛 选培养基。 6.如权利要求1所述的复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法， 其特征在 于， 所述的筛 选培养基为pH值 为6.5。 7.如权利要求1所述的复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法， 其特征在 于， 所述的筛 选培养采用的培 养温度为37℃。 8.如权利要求1所述的复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克曼氏菌的方法， 其特征在 于， 所述的筛 选培养采用的混合气体 配比为90％N2、 5％H2、 5％CO2。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115141778 A 2一种复合调控剂特异性筛选嗜黏 蛋白阿克曼氏菌的方 法 技术领域 [0001]本发明属于微生物技术领域， 具体涉及一种复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋白阿克 曼氏菌的方法。 背景技术 [0002]嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia  muciniphila， Akk菌)存在于人体肠道内， 作为 人体肠道 的常驻民， 占人体微生物群落的3～5％， 其标准菌株MucT于2004年由Derrien分 离， 为卵圆形， 革兰阴性的厌氧菌， 是疣微菌门的代表。 Akk菌是一种粘蛋白分解细菌， 将黏 蛋白作为碳、 氮元素和能量的唯一来源， 即利用位于肠上皮的杯 状细胞所分泌的黏蛋白 “为 食”， 从而促进肠上皮干细胞的增殖， 维持肠屏障功能完整性。 近年来大量的人类和动物研 究已经解决了A kk菌丰度与各种疾病的关系问题。 A kk菌丰度被认 为与代谢紊乱以及炎症 性 疾病呈负相关， 包括肥胖、 II型糖尿病、 炎症 性肠病(IBD)、 渐冻症、 癫痫、 自闭症和特异反应 性等。 [0003]Akk菌最初由荷兰瓦格宁根大学的Derrien分离得到， 国内的南方医科大学彭永正 教授团队依靠Derr ien团队的方法从中国南方人群中分离到22株Akk菌。 江南大学翟齐啸教 授团队通过改进Derr ien团队的方法， 发 明了一种Akk菌特异性筛选培养基， 可使Akk菌筛选 的阳性率高达70％。 这三个团队的方法都是先采用只含有 纯化的猪胃黏蛋白的富集培养基 进行富集培养， 然后再选择出现浑浊度最低的富集培养液进行分离培养， 其中会涉及到配 制添加碱性溶液、 酸性溶液、 无机 盐溶液， 纯化黏蛋白等步骤， 不仅实验步骤繁琐， 还存在一 些试剂稀有、 价格昂贵等的问题， 不利于实验室中快速准确地筛选分离Akk菌。 另有吉林大 学杨勇军教授团队采用万古霉素固体培养基的方法从健康小鼠粪便中筛选 分离到两株A kk 菌， 其平板分离法简化了Akk菌筛选分离的步骤， 但发明人在具体实施 时， 发现在万古霉素 固体培养基上面生长出很多杂菌， 其中以产臭菌株为主， 很难从这些菌株中筛选出Akk菌。 分析发现万古霉素只能抑制革兰氏阳性菌， 对于不是A kk菌的革兰氏阴性菌并无抑制效果， 因此找到能够抑制这些革兰氏阴性菌， 且不抑制Ak k菌的抗生素调控剂目前还未 见报道。 [0004]中国专利号CN201910721005.6公开了一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌的厌氧培养方法， 所述的培养基为改良BHI培养基中添加Mucin和Yeast  Exctact， 能使Akk菌在平板表面生 长， 且使得Akk菌的生长速度由使用普通黏蛋白培养基(BHI+黏蛋白)的3～4d降为24～36h， 极大的缩短了培养时间， 符合快速分离筛选的要求。 因为该方法能使Akk菌快速生长， 所以 本发明中涉及到的改良BHI培养基是参考该专利方法， 实际实施时只要能够培养A kk菌的培 养基都能采用， 其中Akk菌的生长速率则由培养基的特性决定。 所以为了提高筛选成功率， 将复合调控剂与改良BHI培养基相结合， 发明一种特异性筛选Akk菌的方法， 使得研究人员 能够快速准确地筛 选到Akk菌， 以便进行深入研究。 发明内容 [0005]针对现有技术存在的上述缺点， 本发明提供了一种复合调控剂特异性筛选嗜黏蛋说　明　书 1/7 页 3 CN 115141778 A 3