(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210634623.9 (22)申请日 2022.06.07 (71)申请人 南京农业大 学 地址 210095 江苏省南京市玄武区卫岗1号 (72)发明人 荀卫兵　张瑞福　王文瑜　任轶　 沈其荣　 (74)专利代理 机构 南京天华专利代理有限责任 公司 32218 专利代理师 傅婷婷　徐冬涛 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C12R 1/38(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种复合菌 群混合发酵 方法 (57)摘要 本发明公开了一种复合菌群 混合发酵方法。 所述的混合发酵技术基于不同菌株的代谢底物 竞争强度、 最佳培养条件、 生长速度、 代谢产物对 菌株共存的影 响等特征， 建立了 “分批接种 ‑条件 控制‑按需补料 ”的合成菌株混合发酵体系。 该发 酵技术具备资源消耗低、 发酵产物菌种组成均一 度高的特点， 与常规混菌发酵方式相比， 在摇瓶 体系中发酵24小时能提高总菌体数量约1.5个数 量级， 发酵罐扩 大培养能在摇瓶体系基础上再提 高0.37个数量级。 权利要求书2页 说明书9页 附图13页 CN 115232762 A 2022.10.25 CN 115232762 A 1.一种复合菌群的混合发酵方法， 所述的复合菌群由8株根际益生细菌组成， 分别为鲍 曼不动杆菌(A cinetobacter  baumannii)RFA ci‑1、 施氏假单胞菌(Pseudo monas stutzeri) RFPse‑1、 日本假黄单胞菌(Pseudoxanthomonas  japonensis)RFPth ‑1、 洋葱伯克氏菌 (Burkholderia  cenocepacia)RFBur ‑1、 嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas   maltophili a)RFSte‑1、 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus  amylolique faciens)RFBac ‑1、 土壤溶 杆菌(Lysobacter  soli)RFLys ‑1和路德维希肠杆菌(Enterobacter  ludwigii)RFEnt ‑1； 上 述八株菌株皆保藏于中 国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物中心， 保藏日期均为2020 年12月07 日， 鲍曼不动杆菌RFAci ‑1保藏编号为CGMCC  No.21321、 施氏假单胞菌RFPse ‑1保 藏编号为CGMCC  No.21322、 日本假黄 单胞菌RFPt h‑1保藏编号为CGMCC  No.21323、 洋葱伯克 氏菌RFBur ‑1保藏编号为CGMCC  No.21324、 嗜麦芽寡养单胞菌RFSte ‑1保藏编号为CGMCC   No.21325、 解淀粉芽孢杆菌RFBac ‑1保藏编号为CGMCC  No.21326、 土壤溶杆菌RFLys ‑1保藏 编号为CGMCC  No.21327、 路德维希肠杆菌RFEnt ‑1保藏编号为CGMCC  No.21328； 其特征在于 所述的混合发酵方法包含以下步骤:(i)先将菌株RFPth ‑1、 RFSte‑1、 RFBur‑1和RFAci ‑1种 子液接种到基础培养基中， 设置培养温度为35 ‑37℃、 pH为7.0 ‑7.5， 发酵2h； (ii)将菌株 RFPse‑1种子液接种到发酵液中， 用缓冲液调节发酵体系pH值为7.5， 设置培养温度为35 ‑37 ℃， 发酵4h； (iii)将 菌株RFLys ‑1种子液接种到发酵液中， 第一次补 充蔗糖至基础培养基浓 度， 用缓冲液调节发酵体系pH值为7.5， 设置培养温度为37℃， 发酵3 ‑6h； (iv)将菌株RFBac ‑ 1和RFEnt ‑1种子液等量混合接种到基础培养基中， 第二次补充蔗糖至基础培养基浓度， 用 缓冲液调节发酵体系pH值为7.5， 设置培养温度为35℃， 发酵15h； 每1000ml基础培养基配方 为： 蔗糖8 ‑10g、 玉米浆粉18 ‑22g、 K2HPO4 3‑5g、 ddH2O 1000ml； 优选蔗糖10g、 玉米浆粉20g、 K2HPO4 3g、 ddH2O 1000ml。 2.根据权利要求1所述的混合发酵方法， 其特征在于所述合成菌群的菌株种子液制备 是将复合菌群的单菌以1％的接种量接种到100ml  TSB培养基中， 在30℃、 170rpm的恒温中 摇床培养至OD600＝1所得。 3.根据权利要求1所述的混合发酵方法， 其特征在于各单菌种子液接种到基础培养基 中的接种量 为1％。 4.根据权利要求1所述的混合发酵方法， 其特征在于所述调节发酵体系pH值的缓冲液 为酸性缓冲溶液和碱性缓冲溶液， 每升所述的酸性缓冲溶液含K2HPO4 5.5g和KH2PO4  0.41g， NaOH调 至pH为10； 每升所述的碱性缓冲溶液含K2HPO4 8.34g和KH2PO4 0.87g、 浓HCl 调至pH为6 。 5.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的混合发酵方法， 其特征在于步骤(i)先将菌株 RFPth‑1、 RFSte‑1、 RFBur‑1和RFAci‑1种子液等量混合至OD600＝1.0， 按1％接种量接种到基 础培养基中， 设置 培养温度为3 5℃、 pH为7.5， 发酵2h 。 6.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的混合发酵方法， 其特征在于步骤(ii)将菌株 RFPse‑1种子液， 按1％接种量接种到发酵液中， 用缓冲液调节发酵体系pH值为7.5， 设置培 养温度为3 5℃， 发酵4h 。 7.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的混合发酵方法， 其特征在于步骤(iii)将菌株 RFLys‑1种子液， 按1％接种量接种到发酵液中， 第一次补充蔗糖至基础培养基浓度10mg/ ml， 用缓冲液调节发酵体系pH值 为7.5， 设置 培养温度为37℃， 发酵3 h。权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115232762 A 28.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的混合发酵方法， 其特征在于步骤(iv)将菌株 RFBac‑1和RFEnt ‑1种子液等量混合至OD600＝1.0， 按1％接种量接种到基础培养基中， 第二 次补充蔗糖至基础培养基浓度10mg/ml， 用缓冲液调节发酵体系pH值为7.5， 设置培养温度 为35℃， 发酵15 h。 9.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的混合发酵方法， 其特征在于在发酵罐中进行混合 发酵时， 装液量 为40％， 发酵 罐罐压维持在0.08Mpa， 转速为20 0rpm、 通气量 为1L/min。 10.根据权利要求1 ‑4中任一项所述的混合发酵 方法， 其特 征在于包 含以下步骤： 步骤(i)先将菌株RFPth ‑1、 RFSte‑1、 RFBur‑1和RFAci ‑1种子液等量混合至OD600＝1.0， 按1％接种量接种到基础培 养基中， 设置 培养温度为3 5℃、 pH为7.5， 发酵2h； 步骤(ii)将菌株RFPse ‑1种子液， 按1％接种量接种到发酵液中， 用缓冲液调节发酵体 系pH值为7.5， 设置 培养温度为3 5℃， 发酵4h； 步骤(iii)将菌株RFLys ‑1种子液， 按1％接种量接种到发酵液中， 第一次补充蔗糖至基 础培养基浓度10mg/ml， 用缓冲液调节发酵体系pH值 为7.5， 设置 培养温度为37℃， 发酵3 h； 步骤(iv)将菌株RFBac ‑1和RFEnt ‑1种子液等量混合至OD600＝1.0， 按 1％接种量接种到 基础培养基中， 第二次补 充蔗糖至基础培养基浓度10mg/ml， 用缓冲液调节发酵体系pH值为 7.5， 设置 培养温度为3 5℃， 发酵15 h； 且， 当使用发酵罐进行混合发酵 时， 装液量为40％， 发酵罐罐压维持在0.08Mpa， 转速为 200rpm、 通气量 为1L/min。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115232762 A 3