(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211109235.5 (22)申请日 2022.09.13 (71)申请人 江苏省农业科 学院 地址 210014 江苏省南京市玄武区孝陵卫 钟灵街50号 (72)发明人 李亚辉　梁颖　高庆超　张志勇　 (74)专利代理 机构 江苏圣典律师事务所 32 237 专利代理师 肖明芳 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 9/24(2006.01) C12G 1/022(2006.01) C12G 3/024(2019.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一种增加酿酒乳酸菌完整细胞在发酵中糖 苷酶活性的方法 (57)摘要 一种增加酿酒乳酸菌完整细胞在发酵中糖 苷酶活性的方法， 该方法包括菌种活化、 菌种扩 大培养、 菌种诱导培养、 菌种适应培养和发酵培 养步骤， 其特征在于， 通过在菌种活化、 菌种扩大 培养、 菌种诱导培养步骤中添加不同的碳源， 在 菌种诱导培养和发酵培养中采用超声波处理， 最 后在发酵培养中调控发酵参数， 以此增加酿酒乳 酸菌完整细胞在发酵中的糖苷酶活性。 通过此方 法， 大大提高了发酵中酿酒乳酸菌完整细胞不同 糖苷酶活性， 促进了发酵中糖苷物质的降解， 大 大增加了果酒的香气， 提升 了果酒的整体品质。 权利要求书2页 说明书9页 CN 115261288 A 2022.11.01 CN 115261288 A 1.一种增加酿酒乳酸菌完整细胞在发酵中糖苷酶活性的方法， 该方法包括菌种活化、 菌种扩大培养、 菌种诱导培养、 菌种适应培养和发酵培养步骤， 其特征在于， 通过在菌种活 化、 菌种扩大培养、 菌种诱导培养步骤中添加不同的碳源， 在菌种诱导培养和发酵培养中采 用超声波处理， 最后在发酵培养中调控发酵参数， 以此增加 酿酒乳酸菌完整细胞在发酵中 的糖苷酶活性； 其中， (1)菌种活化： 将冷冻保存的酿酒乳酸菌在固体培养基上划线20 ‑25℃条件下培养10 ‑ 15天， 所述的固体培 养基， 其碳源为： 葡萄糖5 ‑8g/L， 菊芋 浆100‑150mL/L； (2)菌种扩大培养： 挑取步骤(1)中划线培养后的单菌落， 在 液体培养基中20 ‑25℃下扩 大培养7‑10天； 所述的液体培 养基， 其碳源为： 纤维二糖8 ‑10g/L， 菊芋 浆100‑150mL/L； (3)菌种诱导培养： 将步骤(2)中扩大培养后的培养液以5000g离心5min获得的菌体， 接 入诱导液体培养基A中进 行一次诱导培养； 对一次诱导培养液再次以5000g离心5min 获得的 菌体， 接入诱导液体培养基B中进行二次诱导培养； 分别在一次诱导培养和二次诱导培养的 第2天在50 ‑100w条件 下超声波处理15 ‑20min； 所述的诱导液体培养基A， 其碳源为菊芋提取 物和单糖苷混合物； 所述的诱 导液体培 养基B， 其 碳源为菊芋 提取物和双糖苷混合物； (4)菌种适应培养： 将步骤(3)中二次诱导培养液以5000g离心5min获得的菌体接入适 应培养基中18 ‑20℃下培 养4‑5天； (5)发酵培养： 将步骤(4)中适应培养后的适应培养液以5000g离心5min获得的菌体， 按 湿菌体8‑10g/L的接种 量接种至总糖含量10 ‑20g/L， SO2含量低于30mg/L的果酒中18 ‑20℃ 下发酵15 ‑20天， 分别在发酵培养的第5天和第10天在100 ‑150w条件下超声波处理20 ‑ 30min。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述的酿酒乳酸菌包括酒类酒 球菌Oenococcus oeni和明串珠菌Leucan ostoc中的任意 一种。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)中， 所述的固体培养基， 其碳源为 葡萄糖5‑8g/L， 菊芋浆100 ‑150mL/L， 其他成分为酵母浸粉5g/L， 蛋白胨8 g/L， MgSO4·7H2O  0.15g/L， MnSO4·4H2O 0.02g/L， pH4.3 ‑4.5， 琼脂20g/L。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(2)中， 所述的液体培养基， 其组成成 分为纤维二糖8 ‑10g/L， 菊芋浆100 ‑150mL/L， 酵母浸粉5g/L， 蛋白胨8g/L， MgSO4·7H2O  0.15g/L， MnSO4·4H2O 0.02g/L， pH  4.3‑4.5。 5.根据权利 要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(1)和步骤(2)中， 所述的菊芋浆， 其制 作方法为： 将洗净的菊芋和纯 净水按重量比8 :2混合均匀打浆。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(3)中， 所述的一次诱导培养， 其培养 条件为： 18 ‑20℃， 培养2 ‑3天， 第2天时进行一次超声波处理， 处理条件为50 ‑100w， 超声时间 15‑20min； 所述的二次诱导， 其培养条件为18 ‑20℃， 培养3 ‑4天， 第2天时进行一次超声波处 理， 处理条件为50 ‑100w， 超声时间15 ‑20min； 所述的诱导液体培养基A， 其碳源为菊芋提取 物和单糖苷的混合物， 两者重量比为1:5 ‑1:6， 添加量为11 ‑12g/L， 其他 成分为酵母浸粉5g/ L， 蛋白胨8g/L， MgSO4·7H2O 0.15g/L， MnSO4·4H2O 0.02g/L， pH  4.3‑4.5； 所述的诱导液体 培养基B， 其碳源为菊芋提取物和双糖苷的混合物， 两者重量比为1:7 ‑1:8， 添加量为12 ‑ 14g/L， 其他成分为酵母浸粉5g/L， 蛋白胨8g/L， MgSO4·7H2O0.15g/L， MnSO4·4H2O 0.02g/权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 115261288 A 2L， pH 4.3‑4.5。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(4)中， 所述的适应培养基， 其组成成 分为： 葡萄糖5 ‑8g/L， 乙醇含量5 ‑8％v/v， SO2含量20‑25mg/L， 葡萄皮糖苷提取物15 ‑20mL/ L， 酒石酸3 ‑4g/L， 苹果酸1 ‑2g/L， K2HPO4 1‑1.5g/L， MgSO4·7H2O 0.1‑0.15g/L， MnSO4·H2O  0.02‑0.04g/L， 酵母 浸粉1‑1.8g/L， pH  3.5‑3.8。 8.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 步骤(5)中， 所述的果酒主要包括葡萄酒、 蓝莓酒、 苹果酒、 海棠酒中的任意 一种。 9.根据权利要求1或6所述的方法， 其特征在于， 所述的单糖苷为熊果苷和树莓苷中的 任意一种， 所述的双糖苷为 京尼平龙胆双糖苷、 甜菊双糖苷、 点地梅双糖苷中的任意两种的 组合， 其质量比为1:1。 10.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于， 所述的糖苷酶包括葡萄糖苷酶、 阿拉伯糖 苷酶、 鼠李糖苷酶和芹菜糖苷酶。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 115261288 A 3