(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210670903.5 (22)申请日 2022.06.15 (71)申请人 扬州大学 地址 225009 江苏省扬州市邗江区大 学南 路88号 (72)发明人 杨辉　张莹莹　曹清晟　江逸楠　 (74)专利代理 机构 南京纵横知识产权代理有限 公司 32224 专利代理师 刘艳艳 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) A61K 35/742(2015.01) A61P 31/04(2006.01) C12R 1/125(2006.01) C12R 1/07(2006.01) (54)发明名称 一种基于芽孢杆菌发酵产物的抗菌剂及其 制备方法和应用 (57)摘要 本发明公开了一种芽孢杆菌发酵产物的制 备方法及应用。 制备方法为： S1： 制备菌株的液体 制剂； 爆气自来水 或者井水100Kg+芽孢1Kg （枯草 芽孢杆菌CK3  500g+凝结芽孢杆菌500g） +红糖 5kg+氮肥 （尿素） 200g， 温度在 26℃‑35℃， 每天需 搅拌一次， 容器不密封， 培养72小时以上； S2： 细 菌上清液粉剂制备： 将菌株的液体制剂混合均 匀， 放入离心机5000  rpm 30 min； 将离心完成后 的上清收集放入1000  Da的透析袋中， 于冰水浴 中透析24 h， 每6小时更新一次外围冰水； 透析完 成后的液体在超低温冰箱预冷后， 放入冷冻干燥 机10pa  ‑60℃冻干成粉末。 本发明的发酵产物的 抗菌抑菌作用显著， 可作为抗生素的替代品和保 健类应用于水产养殖病害防控中。 权利要求书1页 说明书4页 附图1页 CN 114958676 A 2022.08.30 CN 114958676 A 1.一种芽孢杆菌发酵产物的制备 方法， 其特 征在于， 包括： 将芽孢杆菌菌种接种于扩大发酵培养基中， 温度在26℃ ‑35℃， 有氧发酵培养72小时以 上使菌体数量在109cfu/mL以上； 离心收集发酵上清液， 并在截留分子量为1000Da的透析袋 中进行透析， 真空冷冻干燥即得； 所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌的混合物， 其中所述枯草芽孢杆菌 Bacillus  subtilis ， 采用枯草芽孢杆菌  CMCC(B) 63501； 所述凝结芽孢杆菌 Bacillus   coagulans ， 采用凝结芽孢杆菌NBRC12714。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 所述枯草芽孢杆菌CK3  和凝结芽孢杆 菌菌种接种的质量比例1:1。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 扩大发酵培养基组分为： 食用红糖50   g/L， 尿素2g/L， 溶于蒸馏水中， 并在120 ‑122℃下高压灭菌18 ‑22min， 接种枯草芽孢杆菌： 凝 结芽孢杆菌 =1： 1； 每1kg芽孢杆菌， 采用的扩大发酵培养基的组成为： 食用红糖5  kg、 尿素200  g溶于无菌 水100 kg中， 灭菌即得。 4.根据权利要求1所述的制 备方法， 其特征在于， 离心为  4000‑6000 rpm 转速下离心 10‑30 min。 5.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 透析为采用无菌的PBS溶液为透析液， 4℃下透析24h 。 6.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 真空冷冻干燥为在10pa、   ‑60℃条件 下冷冻干燥成粉末。 7.一种芽孢杆菌发酵产物， 其特征在于， 通过权利要求1 ‑6任一项所述的制备方法制备 得到。 8.权利要求7 所述的芽孢杆菌发酵产物用于制备抑制细菌制剂的应用。 9.权利要求7所述的应用， 其特征在于， 所述细菌包括大肠杆菌、 维氏气单胞菌、 嗜水气 单胞菌、 金黄色葡萄球菌、 克 雷伯氏菌、 霍乱弧菌 。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114958676 A 2一种基于芽孢杆菌发酵产物的抗菌剂及其制备方 法和应用 技术领域 [0001]本发明属于微生态制剂技术领域， 更具体地， 涉及一种基于芽孢杆菌发酵产物的 抗菌剂及其制备 方法和应用。 背景技术 [0002]细菌性疾病一直是制约水产养殖业发展的重要因素。 细菌性疾病不仅会造成水产 动物的大量死亡， 还会诱导病毒性疾病的爆发， 导致大规模水产动物疫病， 给水产养殖业带 来巨大的威胁。 因此， 控制水产养殖环境中病原菌的数量， 对于水产动物疫病防控具有重要 的意义。 目前， 针对 水产病原菌的控菌方法主要使用化学消毒剂和抗生素。 化学消毒剂虽然 控菌效率高， 但是有效成分易降解、 控菌时效短， 会造成病菌的反弹， 过量使用对养殖对象 有急性毒性效应。 而抗生素的滥用会导致多种病原菌产生 耐药性， 同时在水生动物、 水体中 药物残留的毒副作用给食品安全、 养殖环境以及自然生态环 境都带来巨大威胁。 因此， 开 发 研究新型 的水产养殖控菌手段和技术方法， 对于水产动物病害防控具有十分重要的作用。 微生态制剂是近年来国内外迅速崛起的一类新型微生物添加剂， 具有调节肠道菌群平衡、 拮抗病原菌、 促进动物生长、 提高饲料转化率和增强机体免疫功能等优点， 已被广泛应用于 畜、 禽、 渔养殖业和饲料业， 亦成为了抗 生素的理想替代品。 发明内容 [0003]芽孢杆菌是一类革兰氏阳性菌， 被认为是水产动物中的益生菌， 在健康养殖过程 中发挥着重要的作用。 随着人们对芽孢杆菌产生的活性代谢产物不断地深入研究， 发现了 大量各种类型的抗菌物质， 主要包括脂肽类抗菌物质， 多肽类抗菌物质， 酚类、 氨基糖苷类 化合物、 异构香豆素类化合物等抗菌物质。 这些抗菌物质在能够杀菌的同时， 又不破坏动物 体内的正常细胞， 对人体安全， 在生物医药方面具有重要的应用价值。 因此， 开发有效的芽 孢杆菌抗菌制剂对于水产养殖中细菌性病害的防控具有重要的意 义。 [0004]本发明提供了芽孢杆菌CK3和凝结芽孢杆菌发酵产物制剂， 以解决畜禽生产过程 中过量使用抗生素而导致的畜禽肠道内微生物菌群失衡、 疾病增加、 药物残留技术问题， 同 时本发明又增 加了微生态制剂的种类， 解决了药物 残留所带来的食品安全问题。 [0005]为了实现上述目的， 根据本申请的一个方面， 提供了一种基于芽孢杆菌发酵产物 的抗菌剂及其制备方法。 该发酵产物的制备方法包括： 以枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌发 酵液为原料， 经 过透析、 干燥、 粉碎制备而成； 本发明的技 术方案如下： 第一方面， 提供一种芽孢杆菌发酵产物的制备 方法， 包括： 将芽孢杆菌菌种接种于扩大发酵培养基中， 温度在26℃ ‑35℃， 每天搅拌1~2次， 有 氧发酵培养72小时以上使菌体数量在109cfu/mL以上； 离心收集发酵上清液， 并在截留分子 量为1000Da的透析袋中进行透析， 真空冷冻干燥即得； 所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CK3  和凝结芽孢杆菌的混合物， 其中枯草芽孢杆菌说　明　书 1/4 页 3 CN 114958676 A 3