(19)国家知识产权局 (12)发明 专利 (10)授权公告 号 (45)授权公告日 (21)申请 号 202210633052.7 (22)申请日 2022.06.07 (65)同一申请的已公布的文献号 申请公布号 CN 114717167 A (43)申请公布日 2022.07.08 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.10453 2015.01.27 CGMCC No.18798 2019.1 1.04 (73)专利权人 微康益生菌 （苏州） 股份有限公司 地址 215200 江苏省苏州市吴江经济技 术 开发区龙桥路10 33号 (72)发明人 方曙光　程文　严涛　陈珂可　 蒋大成　杨恒飞　朱建国　(74)专利代理 机构 北京品源专利代理有限公司 11332 专利代理师 边人洲 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01) C12N 1/04(2006.01) C12R 1/25(2006.01) C12R 1/225(2006.01) C12R 1/01(2006.01) 审查员 邵文博 (54)发明名称 一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳 酸菌的制备方法及应用 (57)摘要 本发明提供一种在人体消化系统内具有高 耐受性的乳酸菌的制备方法及应用， 所述制备方 法包括以下步骤： 将经过活化的乳酸菌菌种接种 于种子培养基中培养， 得到种子液； 将种子液接 种于发酵培养基中进行发酵培养， 在发酵稳定初 期终止发酵， 得到发酵液； 发酵培养基中含有猪 胆盐； 将发酵液进行离心得到菌体； 将菌体进行 消化系统应激处理， 得到经消化系统应激处理后 的菌体； 将经消化系统应激处理后的菌体稀释并 涂布于平板上进行培养， 筛选典型菌落； 重复上 述操作， 得到乳酸菌。 本发明通过发酵过程条件 控制及连续经过消化系统应激 反应来筛选菌体， 提高乳酸菌对消化系统的耐受性。 权利要求书2页 说明书14页 CN 114717167 B 2022.09.06 CN 114717167 B 1.一种在人体消化系统内具有高耐受性的乳酸菌的制备方法， 其特征在于， 所述制备 方法包括以下步骤： （1） 将经 过活化的乳酸菌 菌种接种于种子 培养基中进行培 养， 得到种子液； （2） 将步骤 （1） 得到的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养， 在发酵稳定初期终止 发酵， 得到发酵 液； 所述发酵培 养基中含有猪 胆盐； （3） 将步骤 （2） 得到的发酵 液进行离心， 得到 菌体； （4） 将步骤 （3） 得到的菌体进行消化系统应激处理， 得到经消化系统应激处理后的菌 体； （5） 将步骤 （4） 得到的经消化系统应激处理后的菌体稀释并涂布于平板上进行培养， 筛 选典型菌落； （6） 将步骤 （5） 得到 的典型菌落重复步骤 （1） ‑（5） 的操作， 得到在人体消化系统内具有 高耐受性的乳酸菌； 步骤 （2） 中， 所述发酵培 养的条件为： 接种前pH为6.6 ‑7.0； 所述发酵包括第一发酵阶段、 第二发酵阶段和第三发酵阶段， 所述第一发酵阶段为发 酵开始至发酵开始后1.5 ‑3.5 h， 所述第一发酵阶段的pH为6.8 ‑7.2； 所述第二发酵阶段为 第一发酵阶段结束至对 数末期， 所述第二 发酵阶段的pH为4.0 ‑4.5； 所述第三 发酵阶段为第 二发酵阶段 结束至第二发酵阶段 结束后1‑2 h， 所述第三发酵阶段的pH为7.5 ‑8.0； 所述第一发酵阶段、 第二发酵阶段和第三发酵阶段中发酵培养的温度为37 ±1℃， 搅拌 速度40‑80 r/min； 步骤 （4） 中， 所述消化系统应激处理包括依次进行的模拟唾液应激处理、 模拟胃液应激 处理和模拟肠液应激处理； 所述模拟唾液应激处理的温度为37 ±1℃， 时间为5 ‑10 min； 所 述模拟胃液应激处理的温度为37 ±1℃， 时间为2 ‑4 h； 所述模拟肠液应激处理的温度为37 ±1℃， 时间为1 ‑2 h； 所述菌体进行模拟唾液应激处 理的初始浓度为108‑1010 CFU/mL； 所述模拟唾液应激处理中采用的模拟唾液按质量浓度计包括以下组分： 氯化钾0.4  g/ L、 氯化钠0.4  g/L、 一水合磷酸二氢钠0.8  g/L、 氯化镁0.05  g/L、 一水合氯化钙0.8  g/L和 溶菌酶10 0 mg/L， 所述溶菌酶的酶活≥5 000 U/mg， 所述模拟唾液的pH为6.8 ‑7.2； 所述模拟胃液应激处理中采用的模拟胃液按质量浓度计包括以下组分： 氯化钠2  g/L 和胃蛋白酶12  g/L， 所述胃蛋白酶的酶活≥25 00 U/mg， 所述模拟胃液的pH为2 ‑4； 所述模拟肠液应激处理中采用的模拟肠液按质量浓度计包括以下组分： 磷酸二氢钾7   g/L、 猪胆盐1‑3 g/L和胰蛋白酶40  g/L， 所述模拟肠液的pH为7 ‑8； 步骤 （6） 中， 所述 步骤 （1）‑（5） 的重复次数为20 ‑30次。 2.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （1） 中， 所述培养的温度为37 ±1 ℃； 所述种子培养基按质量浓度计包括以下组分： 蛋白胨5 ‑10 g/L、 酵母浸粉5 ‑10 g/L、 葡 萄糖15‑20 g/L、 柠檬酸三铵2 ‑5 g/L、 乙酸钠3 ‑5 g/L、 磷酸氢二钾2 ‑3 g/L、 硫酸镁0.2 ‑0.5  g/L、 硫酸锰0.05 ‑0.2 g/L和吐温 ‑80 0.8‑1.2 g/L， 所述种子培养基的溶剂为水， pH控制在 6.6‑7.0。 3.根据权利要求1所述的制备方法， 其特征在于， 步骤 （2） 中， 所述接种 的接种量为2 ‑ 8%， 所述发酵培养基按质量浓度计包括蛋白胨10 ‑15 g/L、 酵母浸粉10 ‑15 g/L、 葡萄糖5 ‑10 权　利　要　求　书 1/2 页 2 CN 114717167 B 2g/L、 麦芽糖14 ‑18 g/L、 柠檬酸三铵2 ‑4 g/L、 乙酸钠4 ‑6 g/L、 磷酸氢二钾 2‑4 g/L、 硫酸镁 0.4‑0.6 g/L、 硫酸锰0.1 ‑0.3 g/L、 吐温 ‑80 0.8‑1.2 g/L和猪胆盐0.1 ‑0.3 g/L， 所述发酵 培养基的溶剂为水， pH自然。权　利　要　求　书 2/2 页 3 CN 114717167 B 3