(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210816889.5 (22)申请日 2022.07.12 (71)申请人 云南省烟草农业科 学研究院 地址 650021 云南省昆明市圆通 街33号 申请人 昆明理工大 学 (72)发明人 胡彬彬　邹玲　蔡洁云　张琦　 邹聪明　李振杰　刘志华　刘春波　 夏振远　陈颐　姜永雷　雷丽萍　 冀新威　胡小东　王涛　李宝乐　 (74)专利代理 机构 北京海虹嘉诚知识产权代理 有限公司 1 1129 专利代理师 巩固 (51)Int.Cl. A24B 15/20(2006.01) C12N 1/20(2006.01) (54)发明名称 一种利用高地芽孢杆菌J54降解烟叶中 TSNAs的液态发酵 方法 (57)摘要 一种利用高地芽孢杆菌J54菌株降低烟叶 TSNAs的方法， 包括以下步骤： A、 烟叶粉碎： 将烤 干后的硃砂烟烟叶研磨成粉末， 过筛； B、 菌液制 备： 将甘油 管保存的高地芽孢杆菌J54菌种于LB 固体培养基上划线， 然后置于28 ‑30℃恒温培养 箱中培养， 挑选一颗单菌落转接至LB液体培养基 中， 置于恒温振荡培养箱中培养2 0‑50h得到发酵 菌剂， 然后用无菌去离子水将菌剂的OD值调至 OD600＝1.8‑2.0， 得到菌液； C、 发酵： 将烟叶粉末 加入到无机盐基础培养基中作为菌株的营养源， 经高压蒸汽灭菌后再加入菌液， 所述菌液的使用 量为发酵体系总体积的0.8 ‑1.2％， 置于28 ‑30℃ 恒温振荡培养箱中以150 ‑160rpm/min的转速培 养6‑8天或置于35 ‑37℃恒温振荡培养箱中以 150‑160rpm/min的转速培养7 ‑21天。 本发明开拓 性的通过接种菌种降低烟叶TSNAs。 权利要求书1页 说明书4页 CN 115053983 A 2022.09.16 CN 115053983 A 1.一种利用高地芽孢杆菌J54菌株降低烟叶TSNAs的方法， 其特 征在于包括以下步骤： A、 烟叶粉碎： 将烤干后的硃砂 烟烟叶研磨成粉末， 然后过筛， 得到发酵原材 料； B、 菌液制备： 将甘油管保存的高地芽孢杆菌J54菌种于LB固体培养基上划线， 然后 置于 28‑30℃恒温培养箱中过夜培养至长出单菌落， 挑选一颗单菌落转接至LB液体培养基中， 置 于28‑30℃、 150 ‑160rpm/min恒温振荡培养箱中培养20 ‑50h得到发酵菌剂， 然后用无菌去离 子水将菌剂的OD值调至OD600＝1.8‑2.0， 得到 菌液； C、 发酵： 将烟叶粉末加入到无机盐基础培养基中作为菌株的营养源， 经高压蒸汽灭菌 后再加入菌液， 所述菌液的使用量为发酵体系总体积的0.8 ‑1.2％， 置于28 ‑30℃恒温振荡 培养箱中以150 ‑160rpm/min的转速培养6 ‑8天或置于35 ‑37℃恒温振荡培养箱中以150 ‑ 160rpm/min的转速培养7‑21天。 2.根据权利要求1所述的方法， 其特 征在于在步骤A中过5 0目筛。 3.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于步骤B中所述恒温培养箱和恒温振荡培养箱 的温度为28℃， 所述恒温振荡培 养箱为15 0rpm/min， 培养48h， OD值调至OD600＝2.0。 4.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于步骤C中所述恒温振荡培养箱为160rpm/ min。 5.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于所述高地芽孢杆菌J54菌株的保藏编号为 CCTCC No.M20196 67。 6.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于步骤C中无机盐基础培养基的配方如下， 以 g/L计： K2HPO4： 0.2； KH2PO4： 0.8； MgSO4： 0.2； CaSO4·H2O： 0.1； Na2MoO4： 0.0033； FeSO4·7H2O： 0.005； 按5.00g烟叶粉末对应45ml的无机盐的比例添加。 7.根据权利要求1所述的方法， 其特征在于步骤C所述菌液的每次使用量为烟草培养基 总体积的1％。 8.根据权利要求1所述利用高地芽孢杆菌J54菌株降低烟叶TSNAs的方法， 其特征在于 所述C步骤中烟叶采用液态发酵， 温度设置为28℃， 发酵时间7天。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115053983 A 2一种利用高地芽孢杆菌J54降解烟叶中TSNA s的液态发酵 方法 技术领域 [0001]本发明属于烟草工业技术领域， 具体涉及一种利用高地芽孢杆菌J54菌株降低烟 叶 TSNAs的方法。 背景技术 [0002]烟草特有亚硝胺(TS NAs)是一类烟 碱的总称， 这类烟 碱仅存在 于烟草及烟气中， 属 于 N‑亚硝胺类化合物， 目前已经分离鉴定出的TSNAs共有8种， 研 究较为深入的主要包括4   种含量最高的物质： N ‑亚硝基降烟碱(NNN)、 4 ‑(N‑甲基亚硝胺基) ‑1‑(3‑吡啶基)‑1‑丁酮 (NNK)、 N‑亚硝基新烟草碱(NAT)和N ‑亚硝基假木贼碱(NAB)， 这些物质具有较强 的致癌性， 对吸烟者的健康危害极大。 [0003]早在1962年， 国际上就首次报道了关于TSNAs的潜在致癌作用， 会导致人类口腔、 食道、 胃、 肺部、 胰脏、 肝脏等部位形成肿瘤， 其中， NNN和NNK是致癌性最 强的两种物质， 尤其 对啮齿动物具有强致癌性， NNK被国 际癌症研究机构(IARC)确定为 Ⅰ类致癌物(IARC Group Ⅰ)， 可使动物和人体组织中的DNA出现甲基化， 引发肿瘤的可能性增大。 因此， 降低烟草特有 亚硝胺含量对提高烟草品质和安全性至关重要， 已成为近年的研究热点。 [0004]研究表明， 烟草特有亚硝胺(TS NAs)在成熟采收的鲜烟叶中含量极低， 主要在烟叶 的调制过程中产生和积累。 前人已在 多方面探索了降低烟叶中亚硝胺(TSNAs)的方法， 其中 多涉及烤烟和卷烟的工艺环节 等， 包括使用装置、 烟叶调制、 改进工艺等， 但对烟叶中TSNAs   含量降低的整体效果并不十分明显 。 发明内容 [0005]为了解决现有技术对烟叶中TSNAs含量降低的不足， 本 发明提供一种操作简便， 能 高效定向降解烟叶TSNAs含量且抗逆性 好的利用高地芽孢杆菌J54降低烟叶TSNAs的方法。 [0006]本发明的技 术方案如下： [0007]一种利用高地芽孢杆菌J54菌株 降低烟叶TSNAs的方法， 其特征在于包括以下步 骤： [0008]A、 烟叶粉碎： 将烤干后的硃砂 烟烟叶研磨成粉末， 然后过筛， 得到发酵原材 料； [0009]B、 菌液制备： 将甘油管保存的高地芽孢杆菌 J54菌种于LB固体培养基上划线， 然后 置于28‑30℃恒温培养箱中过夜培养至长出单菌落， 挑选一颗单菌落转接至LB液体培养基 中， 置于28 ‑30℃、 150 ‑160rpm/min恒温振荡培养箱中培养20 ‑50h得到发酵菌剂， 然后用无 菌去离子水将菌剂的OD值调至OD600＝1.8‑2.0， 得到 菌液； [0010]C、 发酵： 将烟叶粉末加入到无机盐基础培养基中作为菌株 的营养源， 经高压蒸汽 灭菌后再加入菌液， 所述菌液的使用量为发酵体系总体积的0.8 ‑1.2％， 置于28 ‑30℃恒温 振荡培养箱中以150 ‑160rpm/min的转速培养6 ‑8天或置于35 ‑37℃恒温振荡培养箱中以 150‑160 rpm/min的转速培养7‑21天。 [0011]优选的， 在步骤A中过5 0目筛。说　明　书 1/4 页 3 CN 115053983 A 3