(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211006159.5 (22)申请日 2022.08.22 (83)生物保 藏信息 CGMCC NO.2549 9 2022.08.08 (71)申请人 北京青蓝伟业科技有限公司 地址 100192 北京市海淀区西小口路6 6号 中关村东升科技园 ·北领地B-3楼3层 301 申请人 北京大北农科技 集团股份有限公司 (72)发明人 庞远祥　崔东良　张海亮　韩瑞玲　 万红兵　吴昊　张乐　孙晓杰　 刘滢　李碧晨　黄翠英　范祥伟　 刘雪连　 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01)A23K 10/18(2016.01) C12R 1/125(2006.01) (54)发明名称 一株枯草芽孢杆菌及其液固双相发酵 方法 (57)摘要 本发明属于微生态领域， 本发 明提供了一株 枯草芽孢杆菌新菌株， 其保藏编号为CGMCC   NO.25499， 本发明的枯草芽孢杆菌 具有良好的产 酶和抑菌 特性。 本发明还提供了一种液固双相发 酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法。 本发明通过优 化芽孢杆菌发酵培养基配方， 显著提升了枯草芽 孢杆菌的有效活菌数。 本发明通过液体深层发 酵， 得到液体发酵产物， 将液体发酵产物接种于 固体发酵培养基中， 进行固体发酵， 得到枯草芽 孢杆菌发酵物； 将枯草芽孢杆菌发酵物烘干后粉 碎即得枯草芽孢杆菌菌剂。 本发 明利用廉价碳氮 源作为培养基结合液固双相发酵工艺生产枯草 芽孢杆菌菌剂， 提高有效活菌数， 降低菌剂 的原 料与后处 理成本。 权利要求书1页 说明书10页 附图2页 CN 115181707 A 2022.10.14 CN 115181707 A 1.一株枯 草芽孢杆菌(Baci llus subtilis)， 其保藏编号 为CGMCC NO.25499。 2.一种液固双相发酵生产枯 草芽孢杆菌 菌剂的方法， 其特 征在于， 包括以下步骤： (1)所述枯草芽孢杆菌一级种子液培养： 取所述枯草芽孢杆菌平板单菌落， 接种于一级 种子培养基中， 装液量5 0mL/150mL， 37℃培 养18小时， 得到一级种子液； (2)所述枯草芽孢杆菌二级种子液培养： 将步骤1培养的所述枯草芽孢杆菌一级种子液 接种于二级种子培养基中装 液量100mL/250mL， 接种量3％， 37℃培养8～10h， 得到二级种子 液； (3)所述枯草芽孢杆菌液体发酵： 液体发酵培养基灭菌结束后通冷却水保温至37℃， 接 入二级种子液， 接种量3％， 搅拌速度180rpm， 维持pH  7.0， 通气量为0.5～1.5vvm， 发酵时间 为24h； (4)所述枯草芽孢杆菌固体发酵： 将液体发酵后的产物接种于已灭菌的固体发酵培养 基中， 接种量10％(v/m)， 堆料厚度3～5 cm， 37℃培 养72h， 每隔24h翻动一次培 养基； (5)将所述固体发酵后的发酵物 烘干粉碎后即得 所述枯草芽孢杆菌 菌剂。 3.根据权利 要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(1)和步骤(2)的种子培养基为LB 培养基。 4.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)液体发酵培养基组分及其用 量为： 玉米粉5～10g/L,蔗糖4～8g/L， 豆粕8～24g/L， 硫酸亚铁0.125～0.5g/L， 硫酸锰 0.125～0.5g/L， 碳 酸钙0.5～ 2g/L， 磷酸 二氢钾0.5～ 2g/L， 硫酸镁1.25～5g/L。 5.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(3)液体发酵培养基组分及其用 量为： 玉米粉5 g/L， 蔗糖8g/L， 豆粕24g/L， 硫酸亚铁0.125 g/L， 硫酸锰0.5 g/L， 碳酸钙 1g/L， 磷酸二氢钾1g/L， 硫酸镁3.75g/L。 6.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)固体发酵培养基组分及其用 量为： 麦麸45％， 葡萄糖5％， 稻壳粉20％， 玉米粉20％， 海藻糖5％， 豆粕5％。 7.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(4)固体发酵培养基组分及其用 量为： 玉米粉10％， 麦麸6 0％， 稻壳粉20％， 蔗糖5％， 豆粕5％， 料 液比为60％。 8.根据权利要求2所述的方法， 其特征在于， 所述步骤(5)具体为： 将所述枯草芽孢杆菌 固体发酵物在温度不高于50℃的条件下烘干至含水量10％， 粉碎后即得枯草芽孢杆菌菌 剂。 9.含有权利要求1所述 枯草芽孢杆菌 菌株的微 生态制剂。 10.含有权利要求1所述 枯草芽孢杆菌 菌株的饲料。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115181707 A 2一株枯草芽孢杆菌及其液固双相发酵 方法 技术领域 [0001]本发明属于微生态领域， 具体而言， 涉及一株枯草芽孢杆菌及其液固双相发酵方 法。 背景技术 [0002]随着集约化养殖业的发展， 抗生素在畜禽饲料中的用量越来越大， 抗生素的药物 残留和抗药性对人类健康的影响带来许多不良影响。 饲用益生菌是近年来出现的一类新型 饲料添加剂， 它可直接饲喂动物并通过调节动物肠道微生态平衡达到预防疾病、 促进动物 生长和提高饲料利用率的目的， 其中芽孢杆菌是应用最广泛的一类饲用益生菌， 因为芽孢 杆菌以孢子形式存在， 具有耐热、 耐酸、 耐胆盐的特性， 在饲料制粒过程中损失较少， 进入肠 道后可以萌发为具有新陈代谢作用的益 生菌群。 [0003]枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)具有很强的抑菌作用。 枯草芽孢杆菌作为益 生菌， 在发酵过程中能产生抑菌活性肽和淀粉酶、 蛋白酶等， 其发酵产物对抑制肠道有害 菌、 促进营养物质消化吸收有重要作用。 目前， 枯草芽孢杆菌主要用于抑菌植物性病原菌， 防止病害、 调节生长； 对于金葡、 大肠、 沙门等动物性病原菌， 枯草芽孢杆菌多数呈窄谱抑 菌。 [0004]当前， 国内外生产芽孢菌剂方法主要包括液体深层发酵与纯固体发酵。 其中， 液体 深层发酵存在生产成本高、 难以得到高密度的活菌与芽孢、 代谢物 不能充分利用、 后续处理 复杂(如发酵液真空浓缩， 固态粉剂载体的吸附， 干燥等)、 有废液排放等弊端， 而纯固体发 酵由于多级固体扩种增加染菌风险且工艺复杂、 发酵周期 长， 因此不适合推广使用。 如何在 保证有效活菌数的同时兼顾生产成本， 成为困扰芽孢菌剂实际工业 生产的瓶颈问题。 发明内容 [0005]针对上述技术问题， 本发明提供了一株枯草芽孢杆菌新菌株。 本发明还提出一种 液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法旨在利用廉价碳氮源作为培养基结合液固双 相发酵工艺生产枯草芽孢杆菌菌剂， 提高有效活菌数， 降低菌剂的原料与后处理成本， 为建 立规模化的发酵工艺 提供参考依据。 [0006]为实现上述 技术目的， 本发明的技 术方案是这样实现的： [0007]首先， 本发明提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus  subtilis)新菌株， 该菌株在LB培 养基上的菌落形态 为菌落乳白色， 表 面粗糙、 边缘不规则。 经16S  rRNA分析鉴定为枯草芽孢 杆菌， 命名为枯草芽孢杆菌BS ‑ZPW， 并于2022年8月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委 员会普通微生物 中心， 简称CGMCC， 地址： 北京市朝 阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生 物研究所， 保藏编号 为： CGMCC NO.25499。 [0008]其次， 本发明还提供了一种液固双相发酵生产枯草芽孢杆菌菌剂的方法， 包括以 下步骤： [0009](1)所述枯草芽孢杆菌一级种子液培养： 取所述枯草芽孢杆菌平板单菌落， 接种于说　明　书 1/10 页 3 CN 115181707 A 3