(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210711649.9 (22)申请日 2022.06.22 (83)生物保 藏信息 GDMCC NO： 624 48 2022.04.29 (71)申请人 华南理工大 学 地址 510640 广东省广州市天河区五山路 381号 (72)发明人 吴平霄　吕冰欣　陶红娟　李义豪　 牛文超　朱能武　党志　 (74)专利代理 机构 广州粤高专利商标代理有限 公司 44102 专利代理师 林奕聪 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/02(2006.01)C12N 1/36(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 15/01(2006.01) C05F 11/08(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一株兼具硫还原和铁还原能力菌株及其筛 选与菌剂制备方法 (57)摘要 本发明公开了一株兼具硫还原和铁还原能 力菌株及其筛选与菌剂制备方法。 从大宝山矿区 选出一株硫酸盐还原能力和铁还原能力较强的 菌株， 利用紫外线 ‑等离子体复合诱变技术对该 菌株进行多次复合诱变， 选育出一株高效且 稳定 性好的菌株。 同时对菌株生长所需营养物质进行 优化， 得到最佳的培养基方案。 本发明还涉及制 备液体和固体菌剂的方法及其应用。 该方法工艺 简便， 原料来源丰富， 适于 工业化生产。 权利要求书4页 说明书8页 附图4页 CN 115161229 A 2022.10.11 CN 115161229 A 1.一株兼具硫还原和铁还原能力菌株， 其特征在于， 所述菌株Enterobacter   chengduensis  SFRB19‑1， 由广东省微生物菌种保藏中心保藏， 保藏编号为GDMCC  NO： 62448， 保藏日期为202 2年04月2 9日。 2.权利要求1所述兼具硫还原和铁还原能力 菌株的筛选方法， 其特征在于， 包括如下步 骤： (1)具有F e(III)还原功能的菌株筛 选； (2)具有硫 还原能力的菌株筛 选； (3)将步骤(1)和步骤(2)所得的菌株互换培养基培养， 具有硫酸盐还原能力的菌株置 于液体培养基A培养4 ‑5d， 具有铁还原能力的菌株置于液体培养基B， 对两类菌株的硫酸盐 还原能力和铁还原能力分别进行检测， 得到硫铁还原能力均比较强的菌株； (4)将步骤(3)所得的菌株进行重金属抗性驯化， 具体为： 将其分别接种于含40， 80， 120mg/LCd2+和100， 300， 500mg/LCr6+的液体培养基A中培养， 在第60、 120、 240、 360、 480、 600、 720和1440min时测量菌液上清液的OD600值， 挑选长势 较好的作为目标菌株， 得到一株 具有重金属抗 性的菌株； (5)将具有重金属抗性的菌株进行诱变， 得到一株耐受重金属且铁硫还原能力较高的 菌株； (6)将所述耐受重金属且铁硫还原能力较高的菌株， 加入带有不同配比的石膏、 针铁矿 的液体培养基A中培养6 ‑7天， 分别选用离子色谱和ICP ‑MS检测培养过程中S O42‑和Fe3+的变 化情况， 分别得到最优添加量石 膏为8‑10g， 针铁矿为0.3 ‑0.5g。 3.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法， 其特征在于， 步骤 (1)的具体步骤如下： (1)取从大宝山矿区所采的根际土样品8 ‑10.00g于100mL容量瓶中， 加入0.5 ‑1mLFe (OH)3悬液及40 ‑50mL无菌去离子水， 在25 ‑30℃下静置 暗光培养5 ‑7d； 将其离心后稀释10 ‑ 1000倍， 分别取80 ‑100 μL在固体培养基A平板上涂布； 选择菌落分布均匀的平板， 全部挑取 单菌落， 分别接入柠檬酸铁液体培养基培养基B中培养； 在培养过程中培养基由黄绿色逐渐 变为白色， 表明柠檬酸铁已被还原； 进行分离纯化， 吸取此培养液80 ‑100 μL， 在固体培养基A 平板上涂布， 培养皿用封口膜密封， 于25 ‑30℃避光培养1 ‑2d； 最大量挑取单菌落， 挑选具有 还原柠檬酸铁能力的培养瓶作为接种 液， 在柠檬酸铁固体培养基上再次涂布， 最大量挑取 单菌落， 转接于液体培养基C中扩繁， 制得菌液， 重复此步骤三次， 得到具有Fe(III)还原功 能的菌株若干； 其中所述固体培养基A其中所述固体培养基A的组成为蛋白胨0.2 ‑0.25g， 胰蛋白胨 0.2‑0.25， 酵母膏0.3 ‑0.5g， 葡萄糖0.3 ‑0.5g， MgSO4·7H2O 0.4‑0.6g， CaCl2 0.5‑0.7g， 琼 脂粉0.8％ ‑1％， 蒸馏水0.8 ‑1L， pH值6.5 ‑7.0； 液体培养基B的组成为柠檬酸铁3.0 ‑3.4g， NH4Cl 0.5‑1g， CaCl20.05‑0.07g， MgSO4· 7H2O 0.5‑0.6g， K2HPO4·3H2O 0.6‑0.722g， KH2PO40.2‑0.25g， 碳源为0.8％ ‑1％葡萄糖， 蒸 馏水1000m， pH值6.5 ‑7.0； 液体培养基C的组成为： 胰蛋白胨5 ‑10g， 酵母粉3 ‑5g， NaCl 5‑ 10g， 蒸馏水0.8 ‑1L， pH值6.8 ‑7.5。 4.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法， 其特征在于， 步骤 (2)的具体步骤如下：权　利　要　求　书 1/4 页 2 CN 115161229 A 2取根际土8 ‑10g分别溶解到装有70 ‑90ml无菌水及玻璃珠的三角瓶中， 密封后 置于恒温 摇床上室温振荡25 ‑30min， 吸取0.8 ‑1ml土壤悬浮液加入到装有70 ‑90ml无菌液体培养基A 的三角锥瓶中， 摇匀， 轻轻加入 无菌液体石蜡封住液面， 液体石蜡层的厚度约为2 ‑3cm， 塞紧 塞子， 30‑35℃恒温静置培养， 4 ‑5d后观察到三角瓶中的液体呈现浓厚的墨色； 采用双皿叠 加法进行菌株的分离纯化； 首先做梯度稀释， 将稀释10‑5‑10‑7倍的土壤悬液加到外皿中， 倒 入事先准备好的呈液态的固体富集培养基B， 立即将菌液与培养基混合均匀， 快速将内皿与 外皿同向叠加， 若有气泡应慢慢挤压排出， 使内外两皿之间呈无氧状态； 最后， 将平板倒置 于生化培养箱中进行培养， 温度设定为30 ‑35℃， 培养3 ‑4d， 观察平板上长出黑色的菌落； 挑 选较大、 生长较快的菌落， 分别接入到装有8 ‑10ml SRB液体富集培养基中， 培养至对数期， 再按照前述方法进一步做梯度稀释， 同样选取梯度为10‑3、 10‑5、 10‑7涂布， 再培养； 重复以上 的操作3次， 直至固体培 养基上长出的为纯菌落， 得到具有硫 还原能力的菌株若干； 其中所述液体培养基A的组成为K2HPO4 0.4‑0.5g， (NH4)2SO4 2.0‑2.5g， NaHCO3 0.4‑ 0.5g， CaCl2 0.1‑0.2g， MgSO4 0.8‑1.0g， 酵母膏1.2 ‑1.5g， 乳酸钠 1.5‑2.0mL中， 0.3 ‑0.5g (NH3)2Fe(SO4)2， 半胱胺酸盐0.3 ‑0.5g， 蒸馏水0.8 ‑1L， pH值6.8 ‑7.2； 其中所述液体培养基B的组成为K2HPO4 0.4‑0.5g， (NH4)2SO4 2.0‑2.5g， NaHCO3 0.4‑ 0.5g， CaCl2 0.1‑0.2g， MgSO4 0.8‑1.0g， 酵母膏1.2 ‑1.5g， 乳酸钠 1.5‑2.0mL中， 0.3 ‑0.5g (NH3)2Fe(SO4)2， 半胱胺酸盐0.3 ‑0.5g， 琼脂粉0.8％ ‑1％， 蒸馏水0.8 ‑1L， pH值6.8 ‑7.2。 5.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法， 其特征在于， 步骤 (3)中， 所述液体培养基A的组成为柠檬酸铁3.0 ‑3.4g， NH4Cl 0.5‑1g， CaCl2 0.05‑0.07g， MgSO4·7H2O 0.5‑0.6g， K2HPO4·3H2O 0.6‑0.722g， KH2PO4 0.2‑0.25g， 碳源为0.8％ ‑1％葡 萄糖， 蒸馏水10 00m， pH值6.5 ‑7.0； 步骤(3)中， 液体培养基B的组成为K2HPO4 0.4‑0.5g， (NH4)2SO42.0‑2.5g， NaHCO3 0.4‑ 0.5g， CaCl2 0.1‑0.2g， MgSO4 0.8‑1.0g， 酵母膏1.2 ‑1.5g， 乳酸钠1.5 ‑2.0mL中， 半胱胺酸盐 0.3‑0.5g， 蒸馏水0.8 ‑1L， pH值6.8 ‑7.2。 6.根据权利要求2所述兼具硫还原和铁还原能力菌株的筛选方法， 其特征在于， 步骤 (4)中， 所述液体培养基A组成为： 胰蛋白胨5 ‑10g， 酵母粉3 ‑5g， NaCl 5‑10g， 蒸馏水1000ml， pH值6.8‑7.5。 7.根据权利要求3所述兼具硫还原和铁还原能力 菌株的筛选方法， 其特征在于， 该菌株 具有以下特性： 在固体培养基A上菌落颜色呈乳白色， 圆形凸起， 边缘整齐； 在固体培养基B 上出现较为分散的黑色菌落， 有整齐的边缘， 圆形菌落的直径约长1.8mm； 在固体培养基C中 为白色菌落， 边缘整齐， 菌落直径大约2mm； SEM扫描电镜图菌体清晰， 聚在一起， 细菌呈杆 状