(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210775230.X (22)申请日 2022.07.01 (71)申请人 中国农业科 学院农田灌溉研究所 地址 453000 河南省新乡市牧野区宏 力大 道 （东） 380号 (72)发明人 崔丙健　刘春成　胡超　崔二苹　 李中阳　樊向阳　高峰　 (74)专利代理 机构 郑州博骏知识产权代理事务 所(普通合伙) 41222 专利代理师 樊超越 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 11/10(2006.01) C12N 11/084(2020.01) C02F 3/34(2006.01)C12R 1/01(2006.01) (54)发明名称 一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性 化微球制备方法 (57)摘要 本发明公开了一株具有溶藻活性的路氏肠 杆菌及其透性化微球制备方法， A： 发酵上清液制 备， 在恒温摇床上培养路氏肠杆菌， 离心去除菌 体， 得到发酵上清液； B、 固定化微球制备， 生物质 炭与发酵上清液按一定比例混合均匀， 再与等体 积的经过灭菌冷却至室温的聚乙烯醇和海藻酸 钠溶液混合均匀， 混合液用注射器滴加到CaCl2 溶液中， 然后进行搅拌持续固定， 用蒸馏水洗涤， 得到直径为3 ‑4 mm的固定化微球； C、 固定化微球 的透性化处理， 将待处理的固定化微球经透性化 处理后投入 无菌水中洗涤。 采用路氏肠杆菌来防 治蓝藻水华， 所用路氏肠杆菌分离自再生水， 无 基因修饰， 取其发酵上清液， 无二次污染风险。 权利要求书1页 说明书7页 附图5页 CN 114921387 A 2022.08.19 CN 114921387 A 1.一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方法， 其特征在于， 包括以下 步骤： A： 发酵上清液制备， 在 恒温摇床上培 养路氏肠杆菌， 离心去除菌体， 得到发酵 上清液； B、 固定化微球制备， 生物质炭与发酵上清液按一定比例混合均匀， 再与等体积的经过 灭菌冷却至室温的聚乙烯醇和海藻酸钠溶液混合均匀， 混合液用注 射器滴加到  CaCl2溶液 中， 然后进行搅拌持续固定， 用蒸馏水洗涤， 得到直径为3 ‑4 mm的固定化 微球； C、 固定化微球的透性化处理， 将待处理 的固定化微球经透性化处理后投入无菌水中洗 涤， 透性化处理后的微球通透性增 加， 反应表面积增大， 反应的扩散能力提高。 2.根据权利要求1所述一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方法， 其 特征在于， 恒 温摇床在25 ‑35℃、 180  rmp条件下培养路氏肠杆菌， 8000  rpm离心去除菌体， 得到发酵 上清液。 3.根据权利要求1所述一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方法， 其 特征在于， 所述生物质炭与发酵上清液按质量比0.8 ‑1.2： 4.5‑5.5混合均匀， 所述聚乙烯醇 和海藻酸钠溶 液中聚乙烯醇和海藻酸钠的体积比为 4.5‑5.5:0.8‑1.2。 4.根据权利要求1所述一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方法， 其 特征在于， 所述混合液用医用注射器于10 ‑15 cm处滴加到20  g/L CaCl2溶液中， 然后在磁 力搅拌器中搅拌持续固定4  h后， 用蒸馏水洗涤3次。 5.根据权利要求4所述一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方法， 其 特征在于， 在搅拌过程中采用顺时针和逆时针循环搅拌的方式进行搅拌， 其中顺时针搅拌 和逆时针搅拌时长相同， 所述搅拌转速为50 ‑80r/min， 由顺时针搅拌切换至逆时针搅拌或 者由逆时针搅拌切换至顺时针搅拌所用时间为30 s， 从而使固定化微球为近似球形， 增加固 定化微球的表面积和反应面积。 6.根据权利要求4所述一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方法， 其 特征在于， 在混合液用医用注射器于10 ‑15 cm处滴加到20  g/L CaCl2溶液过程中， 两个液 滴之间的时间 间隔不小于2s。 7.根据权利要求1所述一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方法， 其 特征在于， 所述透性化处理为物理冻融法处理， 将待处理的固定化微球在 ‑20℃和4℃条件 下反复冻融后投入无菌水中洗涤3 ‑5次， 反复冻融使微球中的冰晶结构破坏， 形成的微囊结 构相当于一个生物反应 器， 易于回收， 可以实现重复利用。 8.根据权利要求7所述一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方法， 其 特征在于， 所述固定化微球在 ‑20℃环境下的时间T1和4℃环境下的时间T2， T1和  T2之比 T1： T2=1:1.2， 从而减少冻融法透性 化处理对微球的损坏。 9.根据权利要求1所述一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方法， 其 特征在于， 所述生物质炭采用花生壳生物质炭， 其具有丰富的多孔结构、 吸 附能力强、 比表 面积大的特点。 10.一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球的应用， 其特征在于， 用于防治蓝 藻水华。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 114921387 A 2一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性化微球制备方 法 技术领域 [0001]本发明属于功能微生物应用于水体环境治理技术领域， 尤其涉及一株具有溶藻活 性的路氏肠杆菌及其透性 化微球制备 方法。 背景技术 [0002]由于工农业污水处理或排放不当， 水体中氮、 磷等营养物质含量过剩引起的富营 养化使蓝藻水华现象频发， 其带来的直接严重后果是破坏水体环境的同时， 也对人畜产生 危害， 甚至直接威胁供水安全， 影响生产生活用水质量。 蓝藻水华频繁暴 发已经成为世界范 围内关注的环境问题， 其主要危害之一是有害藻类水华(Harmful  Algal Blooms,HABs)向 水体中释放具有生物毒性的蓝藻毒素， 包括微囊藻毒素、 蛤蚌毒素、 鱼腥藻毒素、 节球藻毒 素和柱孢藻毒素等对水生生物产生不利影响。 同时， 被这些毒素污染的水体通过灌溉会进 入农田生态系统， 进而影响作 物生长， 并可能通过生物富集效应经食物链威胁人类健康。 物 理、 化学除藻方法不仅投入成本高、 处理方式单一， 还会产生二次污染等问题， 而基于溶藻 菌的微生物防治手段成为抑制藻类生长和改善水环境质量的有效途径。 目前， 已有多株溶 藻菌被发现， 主要 是属于芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌、 枯草芽孢杆菌等， 但 其中仅有少部 分被应用于实际生产中。 如公开号为： CN109593681A 《一种防治 水产养殖蓝藻水华的复合菌 剂及其制备方法和应用》 公开了一种枯草芽孢杆菌与解淀粉芽孢杆菌制成的复合菌剂对水 产养殖蓝藻水华进行防治。 公开号为： CN106148264A 《一株具有增强的溶藻能力的解淀粉芽 孢杆菌及其应用》 公开了一种在解淀粉芽孢杆菌中导入SZ多肽增强其溶藻能力的方法。 公 开号为： CN1563355A 《一种肠杆菌及其制备方法和应用》 公开了一种肠杆菌分离及其菌液对 蓝藻水华的控制 应用， 其作用方式是直接利用肠杆菌菌液喷洒。 现有公开的技术中还没有 利用路氏肠杆菌防治蓝藻水华。 发明内容 [0003]针对现有技术不足， 本发明的目的在于提供一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其 透性化微球制备方法， 采用路氏肠杆菌来防治蓝藻水华， 所用路氏肠杆菌 分离自再生水， 无 基因修饰， 取其发酵 上清液， 无二次污染风险。 [0004]本发明提供如下技 术方案： [0005]一株具有溶藻活性的路氏肠杆菌及其透性 化微球制备 方法， 包括以下步骤： [0006]A： 发酵上清液制备， 在恒温摇床上培养路氏肠杆菌， 离心去除菌体， 得到发酵上清 液； [0007]B、 固定化微球制备， 生物质炭与发酵上清液按一定比例混合均匀， 再与等体积的 经过灭菌冷却至室温的聚乙烯醇和海藻酸钠溶液混合均匀， 混合液用注射器滴加到CaCl2 溶液中， 然后进行搅拌持续固定， 用蒸馏水洗涤， 得到直径为3 ‑4mm的固定化 微球； [0008]C、 固定化微球的透性化处理， 将待处理的固定化微球经透性化处理后投入无菌水 中洗涤， 透性 化处理后的微球通透性增 加， 反应表面积增大， 反应的扩散能力提高。说　明　书 1/7 页 3 CN 114921387 A 3