(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202210930946.2 (22)申请日 2022.08.04 (83)生物保 藏信息 CGMCC No.23627 2021.10.19 (71)申请人 农业农村 部环境保护科研监测所 地址 300191 天津市南 开区复康路31号 (72)发明人 叶会科　王振楠　李永涛　孙扬　 李晓晶　赵丽霞　翁莉萍　白默涵　 (74)专利代理 机构 天津盛理知识产权代理有限 公司 12209 专利代理师 韩晓梅 (51)Int.Cl. C12N 1/20(2006.01) C12N 1/36(2006.01) C12N 1/02(2006.01)C02F 3/34(2006.01) B09C 1/10(2006.01) C12R 1/01(2006.01) C02F 101/38(2006.01) (54)发明名称 一株具有四环素类抗生素降解功能的类芽 孢杆菌、 方法及应用 (57)摘要 本发明公开一株具有四环素类抗生素降解 功能的类芽孢杆菌(Paenibacillus)， 所述菌株 的名称为： Paenibacillus  sp.AEPI 0‑1， 分类名 称为 ： 类芽孢杆菌 ， 保藏 编号为 ： CGMCC   No.23627， 保藏日期： 2021年10月19日， 保藏单 位： 中国微生物菌种保藏管 理委员会普通微生物 中心， 北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 本发明 从长期施用有机肥的设施菜地中富集驯化、 分离 筛选得到一株具有四环素类抗生素 降解效力的 菌株， 本发 明为四环素高效降解菌的工业化应用 提供了理论基础， 有利于丰富四环素类抗生素降 解菌的菌种资源库， 为四环素类抗生素污染的治 理提供有效的生物降解方法。 权利要求书1页 说明书9页 附图4页 CN 115125178 A 2022.09.30 CN 115125178 A 1.一株具有四环素类抗生素降解功能的类芽孢杆菌(Paenibacillus)， 其特征在于： 所 述菌株的名称为： Paenibacillus  sp.AEPI 0‑1， 分类名称为： 类芽孢杆菌， 保藏编号为： CGMCC No.23627， 保藏 日期： 2021年10月19日， 保藏单位： 中国微生物菌种保藏管理委员会 普通微生物中心， 北京市朝阳区北辰西路1号院3号。 2.根据权利要求1所述的类芽孢杆菌， 其特征在于： 所述降解菌菌株通过以下步骤得 到： (1)四环素类抗生素耐受菌的富集、 驯化： 在长期施用有机肥的设施菜地土壤样品悬浮 液中用含有初始浓度为20mg/L的四环素筛选培养基筛选菌种， 并依次用浓度为20mg/L、 50mg/L、 100mg/L、 150mg/L、 2 00mg/L、 400mg/L的四环素筛选培养基进行转接， 富集驯化获得 耐受菌株； (2)类芽孢杆菌的分离和纯化： 将驯化获得的耐受菌株制成耐受菌培养液， 用无菌水稀 释至10‑6、 10‑7和10‑8的稀释液， 然后进行菌株的分离与纯化获得单一菌株， 菌株的分离与纯 化使用传统的平板 涂布法和平板划线法； (3)潜在降解菌的筛选： 将分离纯化获得的单一菌株接种到含四环素类抗生素的培养 基中进行降解实验筛选， 获得具有降解培养基中四环素类抗生素能力的菌株， 经16S  rDNA 鉴定为类芽孢杆菌， 即Paen ibacillus sp.AEPI 0‑1。 3.如权利要求1或2所述的类芽孢杆菌在四环素类抗 生素降解方面中的应用。 4.如权利要求1或2所述的类芽孢杆菌在作为和/或制备降解 四环素类抗生素菌剂方面 中的应用。 5.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于： 所述四环素类抗 生素为四环素。 6.根据权利要求 4所述的应用， 其特 征在于： 所述四环素类抗 生素为盐酸四环素。 7.利用如权利要求1或2所述的类芽孢杆菌去除抗 生素的方法， 其特 征在于： 步骤如下： 将类芽孢杆菌进行活化， 在含有0 ‑5g/L蔗糖、 10 ‑30g/L酵母粉及5 ‑10g/LNaCl的培养基 中接种保种的类芽孢杆菌， 并在25 ‑35℃、 150 ‑250r的恒温摇床中培养24h获得种子液， 将种 子液接种至pH为6.0～10.0的含盐酸四环素抗生素的培养基中进行培养， 培养温度为25～ 37℃， 从而实现抗 生素的快速降解去除。 8.根据权利 要求7所述的方法， 其特征在于： 所述类芽孢杆菌能够对药物浓度为400mg/ L以下的四环素类抗 生素进行降解； 或者， 所述培养基为： 2g/L葡萄糖， 1g/L酵母粉， 1.5g/L蛋白胨， 10g/L氯化钠， 2g/L蔗 糖， 25g/L酵母 粉， 5g/L氯化钠， 初始pH＝7， 121℃灭菌15mi n， 冷却至室温后获得。 9.利用如权利要求1或2所述的类芽孢杆菌制备四环素类抗生素菌剂的方法， 其特征在 于： 步骤如下： 将类芽孢杆菌接种于液体培养基中， 该液体培养基为含有0 ‑5g/L蔗糖、 10 ‑30g/L酵母 粉及5‑10g/LNaCl的培养基， 25℃ ‑30℃条件下， 180r摇床中培养12 ‑24h后收集培养 液， 得到 四环素类抗 生素菌剂。 10.根据权利要求9所述的方法， 其特征在于： 所述液体培养基为： 2g/L葡萄糖， 1g/L酵 母粉， 1.5g/L蛋白胨， 10g/L氯化钠， 2g/L蔗糖， 2 5g/L酵母粉， 5g/L氯化钠， 初始pH＝7， 121℃ 灭菌15mi n， 冷却至室温后获得。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115125178 A 2一株具有四环素类抗生素降解功能的类芽孢杆菌、 方 法及 应用 技术领域 [0001]本发明属于物生物技术领域， 涉及抗生素的生物降解、 环境污染物生物处理， 尤其 是一株具有四环素类抗 生素降解功能的类芽孢杆菌、 方法及应用。 背景技术 [0002]四环素类抗生素是由放线菌产生的一种广谱抗生素， 自被发现以来， 广泛应用于 人类医药行业以减少疾病的发生。 随着社会的发展， 抗生素也逐渐被应用于动物兽药、 水产 养殖以及饲料添加中。 近年来由于抗生素 的大量及不合理的滥用， 在抗生素生产企业以及 养殖场周边的出现了大量含有四环素类抗生素 的废弃物。 据报道， 抗生素进入动物体后并 不能被完全吸收， 约有三成到九成的量以原药 的形式被排出体外， 导致大量的抗生素残留 于动物粪便中。 养殖场中的生物粪便一般被用作于有机肥施于农用地中， 随着雨水 的冲刷 循环， 抗生素进入到土壤、 地表水以及地下水等环境中。 因此， 在土壤、 地表水及沉积物环 境 中检测到 了不同浓度的抗 生素， 这对环境和人类的健康造成了 很大的威胁。 [0003]进入环境中的抗生素不断蓄积， 最终超过环境本身的自净能力， 从而对植物、 微生 物甚至人类均有不同程度的危害。 土壤中的抗生素在植物的根部蓄积， 高浓度的抗生素对 植物的根的生长有一定的抑制作用； 此外植物从土壤中吸收抗生素在植株部分蓄积， 可能 会影响植物的正常生长， 同时在植物植株中蓄积的部分可能会通过食物链传递， 最终进入 动物及人类体内， 从而对人体造成危害。 四环素类抗生素在人体内长期蓄积 达到一定量时， 不仅会引发人类的急慢性中毒， 还可能会对人体的某些器官造成不可逆转的危害， 如 “四环 素牙”等。 同时四环素类抗生素在人体内蓄积会影响白细胞吞噬细胞的能力， 抑制淋巴细胞 的转化， 从而影响人体的免疫系统。 土壤中的抗生素会对微生物群落功能多样性产生抑制 作用， 同时土壤中的微生物长期在抗生素的作用下， 容易产生耐药性， 从而形成抗生素耐药 菌， 降低抗生素的有效性， 抗生素的抗性基因也会随之而来。 抗性基因在微生物之间互相传 播， 加大了细菌的耐药性， 导致抗生素 的无效性增加， 使得抗生素无法发挥其原本的作用， 难以治疗疾病， 对人类的健康造成严重的威胁。 因此， 抗生素在环境中的残留， 是一个全球 性的有待解决的问题。 [0004]四环素类抗生素的去除， 在自然条件下通常是光降解， 除自然条件下的光降解外， 人为参与的一般包括， 物理、 化学、 以及生物降解等。 其中物理降解主要 是物理吸附， 通常是 使用活性炭和膨润土对抗生素进 行吸附去除， 有研究表明两者对抗生素的去除效率可分别 达到95％和88％。 然而物理吸附的方法只能将抗生素从一个介质转移到另一个介质上， 虽 然没有有害物质的产生， 但无法将抗生素彻底去除， 而且存在吸 附材料无法重复使用等弊 端。 化学法主要包括电化学处理和氧化法， 但化学法存在成本高， 无法大面积推广等弊端。 基于物理和化学方法的诸多弊端， 越来越多的学者将目光转移到了生物降解的方法上， 尤 其是微生物降解。 原位分离自土壤的微生物具有适应性强的能力， 而且微生物降解既快速 又高效， 还能避免二次污染和高成本， 因此 受到了许多 学者的青睐。 目前学者们已分离出的说　明　书 1/9 页 3 CN 115125178 A 3