(19)国家知识产权局 (12)发明 专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请 号 202211062208.7 (22)申请日 2022.08.31 (71)申请人 广东医科 大学 地址 524000 广东省湛江市霞山文明东路2 号 (72)发明人 曾今诚　林碧华　叶子瑜　李妍芸　 张雪颖　黄明元　柴星星　邱贤秀　 (74)专利代理 机构 北京汇泽知识产权代理有限 公司 11228 专利代理师 张瑾 (51)Int.Cl. C12N 5/0775(2010.01) C12N 5/078(2010.01) C12N 1/20(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) (54)发明名称 TG模型及构建方法 (57)摘要 本申请公开了一种TG模型及构建方法， 该方 法包含： 将分离的外周血单个核细胞、 间充质干 细胞与卡介苗菌株进行体外共培养。 本申请的TG 模型及构建方法， 通过分别加入TB患者与HV来源 的PBMCs， 建立体外TG模型， 通过对体外TG模型的 研究， 能够很好的探究新的TB诊断标志， 对于筛 选结核病药物靶标或筛选结核病检测标志物具 有极大的指导 意义。 权利要求书1页 说明书6页 附图2页 CN 115418347 A 2022.12.02 CN 115418347 A 1.一种TG模型的构建方法， 其特 征在于， 包 含以下步骤： 将分离的外周血 单个核细胞、 间充质干细胞与卡介苗菌株进行体外共培 养。 2.根据权利要1所述的TG模型的构建方法， 其特 征在于， 所述间充质干细胞为人间充质干细胞； 可选地， 所述间充质干细胞为人肺间充质干细胞； 可选地， 所述外周血 单个核细胞为人外周血 单个核细胞。 3.根据权利要1所述的TG模型的构建方法， 其特 征在于， 在BCG感染复数为0.05 ‑0.15的条件下进行体外共培养， 可选地， 所述体外共培养为3D 体外共培 养； 可选地， 所述BCG感染复数为0.08 ‑0.12， 可选地， 所述BCG感染复数为0.1。 4.根据权利要1所述的TG模型的构建方法， 其特 征在于， 所述卡介苗菌株在进行体外共培养前， 进行预培养； 可选地， 所述预培养培养基选自 7H9培养基； 可选地， 所述预培 养的培养时间为 4周‑6周。 5.根据权利要1所述的TG模型的构建方法， 其特 征在于， 间充质干细胞在进行体外共培养前， 进行预培养； 可选地， 所述预培养培养基选自α ‑ MEM基础培养基； 可选地， 所述预培 养培养基还包括胎牛 血清， 青霉素和链霉素。 6.根据权利要1所述的TG模型的构建方法， 其特 征在于， 外周血单个核细胞在进行体外共培养前， 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细 胞。 7.根据权利要1所述的TG模型的构建方法， 其特 征在于， 外周血单个核细胞、 间充质干细胞体外共培养起始接种密度分别独立地为(0.1 ‑100) ×105个； 可选地， 起始接种密度分别独 立地为(1 ‑10)×105个； 可选地， 起始接种密度分别独 立地为(1‑5)×105个； 可选地， 起始接种密度分别独立 地为1.5×105个。 8.根据权利要1所述的TG模型的构建方法， 其特 征在于， 体外共培 养5‑10天； 可选地， 7天。 9.一种根据权利要求1 ‑8任一所述的TG模型的构建方法所构建的TG模型。 10.权利要求9所述的TG模型在筛 选结核病药物靶标或筛 选结核病检测标志 物的用途。权　利　要　求　书 1/1 页 2 CN 115418347 A 2TG模型及构建 方法 技术领域 [0001]本申请属于细胞模型技 术领域， 具体涉及一种TG模型及构建方法。 背景技术 [0002]结核病(Tuberculosis， TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacterium  tuberculosis， Mtb)感染引起的慢性传染性及肉芽肿性疾病。 据WHO发布的 《2020年全球结核病报告》 显示 中国仍是TB高负 担国家之一， 其发病数位居全球第二。 2019年全球TB患者约有1000万， 而中 国TB患者就有约100万， 这对我国经济社会发展造成了极大的影响。 近年来， 随着多重耐药 Mtb的出现、 艾滋病继发结核感染的病例增多， 导致TB的发病 率呈上升趋势， 结核病现已成 为全球公共卫生问题。 研究发现多重耐药Mtb能通过调节自身 苯丙氨酸代谢、 能量代谢及脂 肪酸代谢， 增加其对抗痨药物卡普霉素和对氨基水杨 酸的耐药性。 Mtb还可通过上调巨噬细 胞miR‑196b‑5p表达抑制巨噬细胞抗炎功能， 并启动异常T细胞包括γδT细胞、 MAIT细胞反 应促使T细胞IL ‑22分泌和BTLA表达进行性丧失， 以及上调T细胞miR ‑16表达促使抗原记忆 性T细胞耗竭和功能弱化。 因此， 早期有效的治疗对TB病情的控制至关重要。 这就要求提供 快速， 可靠和即时的诊断方法， 以进行有效的病例管理。 目前， 筛查和诊断结核病的常用方 法有影像学检查、 内镜检查、 活体组织检查和细菌培养， 但这些方法仍不能准确诊断结核 病。 此外， 细菌培养被认为是结核病诊断和耐药性测试的 “金标准”， 但此方法仍需要4到12 周的时间才能获得最终的确认报告。 因此， 开发新型 特异性TB诊断标志至关重要。 [0003]结核性肉芽肿(Tuberculous  granuloma， TG)是TB的基本病理特征， 也是宿 主免疫 与Mtb的“决战场”。 TG的形成是一个动态的病理过程， 需要多种组分参与， 包括多核巨细胞 (也称Langhans巨细胞)、 类上皮细胞、 免疫细胞、 成纤维细胞、 细胞因子和趋化因子等。 然 而， 目前科学家仍在不断的研究与 发现参与TG形成的组分。 新近越来越多研究证实TB从潜 伏感染者到活动性TB患者的进展主要 取决于感染的局部， 即TG。 因此， 全面了解TG结构对TB 的诊断标志的开发具有较大意 义。 [0004]间充质干细胞(Mesenchymal  stem cells， MSC s)是一种几乎存在于机体所有组织 中的多能干细胞， 它具有干细胞的共性， 即自我更新和多向分化潜能。 在某些生理和实验条 件下， MSCs可分化成特定细胞， 如成骨细胞、 脂肪细胞和神经细胞等， 还可在激活后募集到 组织损伤部位， 再生新的组织并修复缺损。 MS Cs亦可分泌 大量细胞 因子。 近年来有研究发现 骨髓来源MSCs可通过分泌IL ‑6激活鼻咽癌上皮细胞CD73/腺苷受体信号通路， 进而促进细 胞生长和耐药。 MSCs也可迁移至TG， 参与局部环境的免疫调节。 [0005]MSCs与Mtb感染存在关联性。 新近研究发现MSCs可促进脾肉芽肿中Mtb生长， 然而 MSCs经poly(A:U)处理后可抑制脾肉芽肿中Mtb生长， 提示MSCs对Mtb生长具有调节性。 MSCs 可通过清道夫受体(Scavenger  receptor， SR)和甘露糖受体(Mannose  receptor， MR)内化 或吞噬Mtb， 并通过自噬限制Mtb生长。 同时， MSCs还可作为Mtb在TG中休眠的 “壁龛”， 并调节 局部免疫和Mtb耐药过程。 另外， Mtb还可募集MSCs到感染部位抑制T淋巴细胞反应， 从而逃 逸宿主免疫监视 。说　明　书 1/6 页 3 CN 115418347 A 3